發(fā)布時(shí)間：2024-03-15
????2024年3月15日,《eLife》雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為《Deciphering the genetic interactions between Pou4f3,Gfi1,and Rbm24 in maintaining cochlear hair cell survival》的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉志勇研究組完成。研究團隊通過(guò)一系列基因敲除、敲入以及轉基因小鼠模型，揭示了毛細胞維持存活過(guò)程中三個(gè)重要調控基因Pou4f3、Gfi1以及Rbm24之間的相互作用關(guān)系，確定了Pou4f3而非Gfi1正向調控Rbm24基因的表達，并鑒定出3個(gè)之前未知的Rbm24的增強子。同時(shí)，該研究也證明這3個(gè)增強子是在耳蝸毛細胞有活性，可以用于制備毛細胞特異的AAV,用于耳聾基因治療。該研究通過(guò)扎實(shí)的體內遺傳學(xué)實(shí)驗數據，首次闡明了毛細胞存活必需的新基因Rbm24與其它兩個(gè)關(guān)鍵基因Pou4f3與Gfi1的相互作用關(guān)系，為毛細胞存活的分子機制提供了新的見(jiàn)解，并為耳聾治療提供了新的思路與方法。
根據WHO公布的數據，目前有超過(guò)5%的世界人口，即4.3億人（4.32億成年人和3400萬(wàn)兒童）正遭受聽(tīng)力喪失的影響，預估到2050年，患有聽(tīng)力障礙的人數將達到7億人。哺乳動(dòng)物耳蝸內僅存數量有限的毛細胞，它們是聽(tīng)覺(jué)系統中的重要組成部分。毛細胞能夠將聲波轉化為神經(jīng)信號，最終傳遞給大腦，從而感知聲音。然而，有很多耳毒性因素如基因突變、噪音、藥物、衰老等會(huì )導致毛細胞死亡。毛細胞損傷是導致感音性耳聾的主要原因，一旦毛細胞受損，它們便無(wú)法再生，從而致使聽(tīng)力發(fā)生不可逆轉的損傷。因此，探索維持毛細胞存活的分子機制對于預防聽(tīng)力喪失、以及耳聾治療至關(guān)重要。
Pou4f3、Gfi1以及Rbm24都是維持毛細胞存活所必需的基因。有趣的是，Pou4f3或Gfi1基因缺失的毛細胞雖然最初可以形成，但隨后會(huì )迅速死亡。相比之下，Rbm24基因缺失的毛細胞死亡時(shí)間明顯滯后。此外，這3個(gè)基因在耳蝸中的時(shí)空表達模式非常相似。然而，關(guān)于Pou4f3、Gfi1和Rbm24之間的轉錄級聯(lián)調控機制目前知之甚少。該研究通過(guò)構建一系列基因敲除小鼠模型，結合免疫組化分析，發(fā)現Rbm24在Pou4f3-/-毛細胞中的表達被完全抑制（圖1 A-B’’’），但在Gfi1-/-毛細胞中的表達不受影響（圖1 C-D’’）。此外，Pou4f3和Gfi1在Rbm24-/-毛細胞中的表達也不受影響（圖1 E-F’’）。這些研究結果表明：Pou4f3是Rbm24的上游調控必須基因，而Gfi1與Rbm24互不依賴(lài)。
圖1. Pou4f3而非Gfi1是Rbm24的上游調控基因。A-B’’’. Rbm24在Pou4f3-/-毛細胞中的表達完全受到抑制，Bcl11b是外毛細胞的標記基因；A-A’’’. Pou4f3野生型小鼠中Rbm24正常表達；B-B’’’. Pou4f3敲除小鼠中，毛細胞正常，但Rbm24表達完全消失。C-D’’. Rbm24在Gfi1-/-毛細胞中表達不受影響，HA是融合在Gfi1末端的標簽蛋白，用于表征Gfi1蛋白表達情況；與Gfi1野生型毛細胞類(lèi)似（C-C’’），Gfi1敲除的毛細胞中Rbm24的表達未發(fā)生改變（D-D’’）。E-F’’. Pou4f3與Gfi1的表達不受Rbm24缺失的影響。
進(jìn)?一步，通過(guò)分析小鼠耳蝸毛細胞ATAC-seq與Pou4f3的Cut&Run數據，發(fā)現Rbm24基因組上存在3個(gè)能被Pou4f3結合的順式DNA調控序列。研究人員通過(guò)構建轉基因小鼠模型，確定了這3個(gè)順式DNA調控序列是Rbm24的增強子，其誘導的綠色熒光報告基因只在毛細胞內表達。最后，研究人員試圖通過(guò)回補Rbm24，來(lái)緩解或阻止Pou4f3缺失導致的毛細胞退化死亡，結果發(fā)現：僅靠外源性的Rbm24并不能緩解Pou4f3缺失小鼠中毛細胞的丟失。這個(gè)結果提示：Pou4f3-Rbm24的級聯(lián)調控通路只是Pou4f3的下游調控通路之一，其他維持毛細胞存活的Pou4f3下游基因有待后續研究。
圖2. Pou4f3通過(guò)結合Rbm24的3個(gè)增強子來(lái)調控Rbm24的表達。A. Pou4f3能夠與Rbm24基因3個(gè)遠端的順式調控位點(diǎn)結合，A圖上半部分與下半部分分別是IGV軟件可視化毛細胞ATAC-seq（染色體可及性），以及Pou4f3的Cut&Run（轉錄因子結合DNA）的結果。B-G’. Rbm24三個(gè)遠端的調控元件(Eh1,Eh2和Eh3) 均能單獨驅動(dòng)EGFP在耳蝸毛細胞中特異性表達；IHC是內毛細胞；OHC是外毛細胞；Myo7a是毛細胞的標記基因。
總之，該研究為毛細胞存活的分子和遺傳機制提供了新的見(jiàn)解，其中新發(fā)現的3個(gè)Rbm24的增強子對于耳聾基因治療有很高的潛在臨床應用價(jià)值，可用于開(kāi)發(fā)耳蝸毛細胞靶向基因治療的新型AAV工具。
中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心劉志勇研究員為本論文的通訊作者，劉志勇組博士研究生王廣琴為本論文的第一作者，博士研究生顧云鵬也為本項目作出了貢獻。中國科學(xué)院腦智卓越中心光學(xué)平臺和嚙齒類(lèi)實(shí)驗動(dòng)物平臺提供了重要技術(shù)支持。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金委員會(huì )、科技部、上海市科委和中國科學(xué)院的資助。
附件下載： 
